BCA蛋白浓度测定试剂盒完整版
篇一:二辛可宁酸,蛋白检测试剂盒测定什么用的
BCA蛋白浓度测定试剂盒
说明
23225蛋白质化验试剂盒：为500试管或5000微孔板的检测提供充足的试剂 23227蛋白质化验试剂盒：为250试管或2500微孔板的检测提供充足的试剂 试剂盒组分：
BCA 试剂A，1000 mL (No. 23225产品中) 或 500mL ( No. 23227产品中)，碳酸钠， 碳酸氢钠，二喹啉甲酸，酒石酸钠溶于0.1 M氢氧化钠中。
BCA 试剂B , 25 mL, 包括4%硫酸铜
一次性标准白蛋白, 2mg/ mL, 10 × 1 mL 安瓿, 包含2 mg/ mL牛血清白蛋白(BSA) 存在于0.9% 盐和0.05%叠氮化钠 中。
储存：以上试剂保持在室温下储存和装运
注意：如果试剂 A 或 试剂 B 在低温下运输或长期储存时出现沉淀现象，可以通过缓慢加温或轻轻搅拌溶液使沉淀物溶解。当试剂变色或确定微生物污染时请丢球试剂盒。 目录
介绍………………………………………………………………………………………..1
准备标准试剂和工作试剂………………………………………………………………..2
准备试管…………………………………………………………………………………..3
准备微型版………………………………………………………………………………..3
故障检修…………………………………………………………………………………..4
有关美国热电其他产品…………………………………………………………………..5
附加信息…………………………………………………………………………………..5
参考文献…………………………………………………………………………………..6
介绍
美国热电（Thermo）公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒 是基于二喹啉甲酸(BCA)通过比色检测和定量测定总蛋白的洗涤剂兼容配方。该方法通过碱性介质中的一种蛋白结合了Cu2使其显著减少转变为 Cu1 （缩二脲反应）。用一种含二奎琳甲酸的试剂选择性的比色法高敏感的比色杯中的Cu1. 这种测定方法的紫色色反应产物是通过BCA的两个分子和亚铜离子螯合作用形成的。这种水溶性复合物在562nm 处有强吸收峰。在大的活性范围内 (20-2000µg / mL）几乎同蛋白浓度增加呈线性关系。BCA 法不是真正的终点的方法 ；也就是说，最终颜色继续发展。孵化之后, 继续的颜色发展速度是足够慢以允许一起进行测定大量样本。
大分子结构的蛋白质,肽键的数量和存在的四个特定氨基酸(半胱氨酸,胱氨酸，色氨酸和酪氨酸)据说是与BCA形成颜色产物的原因。因此,蛋白浓度的测量通常要参照标准的一个常见的蛋白质如牛血清白蛋白。一系列已知浓度的蛋白质稀释液是为与之相近的未知蛋白质浓度测定准备的。因为每一个未知浓度的测定都需要基于标准曲线。如果需要将一个未知蛋白精确定量，选择一个与未知蛋白特性相似的标准蛋白是可取的。例如，当测定免疫球蛋白时牛血清丙种球蛋白可以被当做标准蛋白。以下给出了两种检测过程：
其中,试管程序需要一个较大的体积(0.1毫升)的蛋白质样品。然而,因为它使用了一个样品比例为1:20的工作试剂(v / v),所以将干扰物质的影响降到最小。在酶处理程序提供了一样品处理酶，需要体积较小(10 -25µL)的蛋白质样品。然而,由于使用了样品比例为1:8的工作试剂(v / v)，所以在克服干扰物质浓度时灵活性降低，从而获得的检测水平较低。
标准试剂和工作试剂的准备（试验程序需要的两个）
A． 准备稀释的BSA标准液
表1为导向,准备一套蛋白质标准。稀释标准的内容为,将一个盛在安瓿管中的标准BSA稀释到几个洁净的瓶子中,最好使用和样本(s)相同量的稀释剂。根据表1的建议：每1毫升的 安瓿管中加入2毫克/毫升的BSA标准液对于准备一系列的标准稀释液是足够的。每个稀释标准重复三次也是足够量的。
表一：准备稀释的BSA标准液
标准试管协议和微型版程序的稀释方案（活性范围=20-2000µg/mL）
加强试管协议的稀释方案（活性范围=5-250µg/mL）
B：准备BCA的工作试剂（WR）
1.总共需要的WR的体积可以通过以下公式计算出来：
（标准液+未知液）×（平行数目）×（每个样品中加入的WR体积）= 总共所需的WR体积
例如：标准的试管程序有三个未知液，每个样品做两组重复：
（标准液9mL+未知液3 mL）×（平行数目2）×（2 mL）=总共所需的WR体积48mL 注意：试管程序中每个样品管加2.0ml WR
微型版程序中每个样品中只需要加200ul WR
2、WR的制备：（BCA 试剂A:B=50:1），对上述样品,将50mL试剂A与1mL试剂B混合。 注意：当试剂B加入到试剂A的开始，浊度观察表明：混合后迅速消失变成澄清的绿色的
ＷＲ。准备充足的WR是基于所测样品数量上的。如果将WR储存在处于室温（RT）的密闭容器中，那么几天之内WR是稳定的。
简要步骤（试管程序，标准方案）
试管程序（样品：WR =1:20）
1、 用移液管移取每个标准品和所测样品的重复0.1ml到有标签的对应试管中。
2、 在每个管中加2.0ml的WR，混匀。
3、 封口，然后温育试管（选择时间和温度）
1）标准方案：37℃ 30min(working range=20-2000ug/ml)
2）RT方案：RT 2h(working range=20-2000ug/ml)
3）Enhanced Protocol(加强方案)：60℃ 30min(working range=5-250ug/ml)
注意：每个实验中都增加培育时间和温度，增加５６２ｎｍ的净吸光度，降低试剂的最低检测水平和方案的工作范围；
使用水浴加热管要么是标准(37°C培养)或是增强(60°C 培养)协议。使用强制的培养可能会因为热传递不均匀使其在颜色变化上引进明显的误差。
4、 使所有管子冷却至室温
5、 分光光度计设定在562nm，当比色皿中装的是水时给仪器校零。随后，确保在10min内测完所有样品的吸光度。
注意：因为BCA测定不是真正的终点，即使冷却到室温颜色还会继续变化。然而，由于在室温下颜色变化速度比较慢，所以如果在10min内测完所有试管的吸光度就不会引进明显的误差。
6、 所有的单个标准品与所测的样品重复在562nm测得的吸光度都要减去在562nm测得
的所有空白标准品的吸光度平均值。
微型板程序（样品：WR =1:8）
1、 用移液管移取25ul的WR到每一个标准品与未知样品所在的微型板中（working range=20-2000ug/ml）
注意：如果样品大小被限制为：每个未知样品和标准品只能使用10ul（sample toWR ratio=1:20）.然而，被测量的working range在这种情况下将被限制为125-2000ug/ml。
2、 每个孔中加200ul的WR，用plate shaker混30s，使其彻底混匀
3、 封口，温育 37℃ 30min
4、 冷却到室温
5、 用酶标仪测量在562nm或接近562nm的读数
注意：1）这种方法中波长在540-590nm的范围内都能被成功的测量
2）因为读板器使用的光线长度比分光光度计的比色皿要短，所以微型板程序需要使用样品比例比较大的工作试剂去获得与标准试管程序相同的灵敏度。如果需要高于562nm的测量，要将培养时间增加到2h.
3）增加培养时间或样品工作试剂的体积比率，增加每个well在562nm的净测量值，降低实际的最低测量水平和测量的working range。只要每个标准样与未知样都被同等对待，这样的修改也是有益的。
6、所有的单个标准品与所测的样品重复在562nm测得的吸光度都要减去在562nm测得的所有空白标准品的吸光度平均值。
7、准备一个标准曲线通过绘制每一个标准BSA在562nm测量的相对于空白对照的吸光度平均值。它ug/ml的浓度。使用标曲去测量每一个未知样品的蛋白质浓度。
注意：如果联系微型板读数器使用拟合的曲线算法，一个有四个参数的或最合适的曲线将提供比纯线性状态更精确的结果。如果用手绘制这个结果，一个点-分曲线将比线性更加适合标准点。
A：干扰物质
某些物质干扰BCA检测是已知的，包括潜在的还原剂，螯合剂，强酸或强碱。因为他们可以干扰估算蛋白质每分钟浓度, 作为样品缓冲液的组份应避免下列物质：
抗坏血酸 EGTA 铁 不纯的蔗糖
儿茶酚胺 不纯的甘油 脂质 色氨酸
肌酸酐 过氧化氢 蜜二糖 酪氨酸
半胱氨酸 酰肼类 苯酚磺酞 尿酸
其他物质对BCA法检测蛋白量有较少程度的干扰。并且这些在原来的样本中低于一定浓度只有很小的影响（可以容忍）。许多物质的最大兼容的浓度在标准测试管协议中被列出。表 2 （见说明的最后一页）。物质是兼容与标准测试管协议中指定的浓度，如果蛋白浓度的估计的误差是由物质的存在所造成将会小于或等于 10 ％。在每一个实验之前，这些物质都会用现配的WR进行测试。空白校正的宰562nm的吸光度测量值（1000µg / mL白蛋白标准品+物质）将会同0.9%生理盐水中精确配制的标准品在562nm出的净吸光度进行比较。样品：WR为1： 8 (v/v)的微孔板过程中最大兼容浓度将比较低。
B .消除或减少干扰物质影响的,策略
BCA蛋白含量测定中干扰物的影响可以用以下几个方法消除或克服。
通过透析或凝胶过滤去除干扰物质。
稀释样品,直到不再有干扰。这种策略只在起始蛋白质浓度足够多余稀释后仍在检测活
性范围之内是有效的。
用丙酮酸或三氯乙酸(TC A) 沉淀样品中蛋白质。液体包含干扰物质将被丢弃，蛋白沉
淀很容易在超纯水中溶解或直接用碱性BCA WR溶解。这一方案的详细流程可从我们网站获得。另外, 23215号产品将被使用 (见相关Pierce产品)。
适当的增加WR中铜的量 (准备WR试剂A:B为 50:2 或50:3、),这将减少铜螯合剂的
干扰
注意:为了最大限度的精确度,蛋白质标准品必须和样品(s)同样处理。
有关美国热电其他产品
15041 96孔板100/pkg
15075 试剂水库200/pkg.
15036 96孔板密封带100/pkg.
23209 标准白蛋白安瓿2mg/ mL 10×1毫升安瓿,包含牛血清白蛋白
23208 预稀释的蛋白质检测标准品：牛血清白蛋白集合，7 × 3.5mL
23212 牛伽玛球蛋白标准品2 mg/mL, 10 × 1 mL安瓿
23235 微型BCA蛋白检测试剂盒工作范围为0.5-20µg / mL
23236 考马斯亮蓝检测试剂盒，工作范围的1 - 1500µg /mL
23215 Compat- Able ™蛋白检测试剂组
23250 BCA蛋白检测试剂盒-兼容还原剂
附加信息
A．请访问我们的网站了解更多的信息,包括下列事项:
常见问答
技术指导：消除样品中干扰物质对蛋白质检测的影响
B .替代总蛋白检测试剂
如果不能克服样品中还原物或金属螯合物的干扰。由一个减少物质或metal-chelating物质包含在,试试美国热电公司的23236号 考马斯亮蓝检测试剂盒，它对这些物质较不敏感。二辛可宁酸,蛋白检测试剂盒测定什么用的。
C. 玻璃器皿的清洁和重利用
Anti-Inflammatory Role of Cannabidio
篇二:二辛可宁酸,蛋白检测试剂盒测定什么用的
大麻的消炎的作用和O- 1602在蛙皮素诱导的小鼠急性胰腺炎的研究
目标：抗炎作用的O- 1602和大麻二酚（CBD）的G 蛋白偶联，配体受体55（ GPR55 ），实验性急性胰腺炎（AP）
方法：急性胰腺炎模型，在C57BL小鼠腹腔每小时注射50Kg/kg蛙皮素，总的6倍。 给予药物（O -1602 ， 10毫克/千克，或CBD ， 0.5毫克/公斤）通过腹膜内注射2次，在第一次注射的前30分钟和之前立即第五蛙皮素注射。最后在注射后3小时，血，肺，胰腺收获的胰腺酶的活性，髓过氧化物酶的活性，促炎细胞因子的测量;和GPR55的mRNA的表达，并在胰腺中的蛋白质进行检测。
结果：大麻或O- 1602治疗显着改善AP小鼠的病理变化和酶的活动性下降， IL-6和肿瘤坏死因子α水平，血浆和器官组织中的髓过氧化物酶的活动。G蛋白偶联受体55的胰腺组织中的mRNA和蛋白的表达，在小鼠与AP的表达明显降低，和大麻二酚（CBD）或O- 1602在一定程度上减弱这些变化。
结论：大麻二酚和O -1602显示出抗炎作用与AP小鼠胰腺组织中，以及提高了表达GPR55的水平 。
关键词：急性胰腺炎，O -1602，大麻， GPR55
急性胰腺炎（AP）是胰腺的炎症性疾病，它潜在的高发病率和死亡率. AP的不同严重程度可以表现出胰腺水肿，轻微的疼痛，胰腺坏死，出血多系统器官功能衰竭，全身炎症反应综合征，不受控制的激活的蛋白水解酶和随后的炎症反应被认为是在AP的发生和发展的重要因素。已报道的细胞因子，如白细胞介素6（ IL -6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）3-5为早期的评估和治疗的目标AP的检测集中。
大麻素的抗炎潜力一直高度感兴趣的话题，因为发现在哺乳动物的内源性大麻素系统。内源性大麻素系统由内源性大麻素受体的内源性配体，和相关的合成和降解酶。有证据表明，大麻素参与炎症的调控并可能成为新的治疗药物，在治疗炎症性疾病。有大麻引起的AP的临床报告，实验报告，确认2 “经典”大麻素受体，大麻素1型受体（CB1）和大麻素2型受体（CB2）起着减轻疼痛和调制AP的角色。结果表明，管理HU210 ，合成特定的CB1受体激动剂，防止蛙皮素诱导的小鼠胰腺炎，否则，CB1拮抗剂利莫那班衰减的严重程度， AP在肥胖小鼠中的内源性大麻素，其中之一的内源性大麻素，诱导的AP前给药时，重新诱导AP严重程度的和给药后诱导的AP ，根据实验结果重新产生的AP的严重程度，而彼得雷拉等人得到了相反的结果，在这种预处理大麻素的前AP的诱导炎症恶化，但治疗后改善了过程中的疾病。
一个毒品的G 蛋白偶联受体55（ GPR55 ）创建于1999年，是支持一个新的CB受体，作为一个非CB1， CB2受体，或大麻暗示的“ 3型” 受体表达和作用的GPR55在AP是远离阐明。大麻二酚（ CBD ）是一个重要的生物活性成分的大麻没有蒜头素的治疗精神病的作用，示出作为GPR55拮抗剂，而不CB1和CB2受体结合。非典型合成大麻素O- 1602是一个模拟“生物多样性公约” ，并确定忽视的结合能力CB1和CB2受体，并作为一个GPR55的激动剂，在本研究中，根据检测GPR55在小鼠胰腺组织中， AP蛙皮素诱导的小鼠模型的处理与“生物多样性公约”或O- 1602 。通过评估胰腺癌组织病理学变化，促炎细胞因子，如IL-6和在血浆和胰腺的水平，和髓过氧化物酶（MPO）活性，肺和胰腺，以及在小鼠胰腺的GPR55 mRNA和蛋白表达的变化，在可能产生的影响新的大麻毒品及其受体GPR55和机制进行了探讨。
材料与方法
动物组：获得了由中国科学院上海实验动物中心，至少有60头成年C57BL小鼠（权重22-26克）的。小鼠在12—12小时光线暗的周期在锯末涂层的塑料笼子和访问标准的实验
室议员和自来水随意在恒定温度23- CT 2 -C和相对湿度约60％ 。动物禁食12小时前实验，随机分为6组，各组小鼠在8到10分：生理盐水组（NS） ， CBD （CBD + NS）组， O- 1602组（O- 1602 + NS ） ，蛙皮素诱导的AP组（AP） ，“生物多样性公约”处理组AP （ CBD + AP ） ，和O - 1602Ytreated AP组（O- 1602 + AP） 。所有动物的研究过程符合国际准则的保养和使用实验动物和同济大学，上海，中国的动物伦理委员会的批准。 胰腺炎感应
小鼠AP模型被复制，根据先前描述的方法。简单地说，在AP组小鼠每小时腹腔注射（IP）的6倍，总50-Kg/kg一定蛙皮素（ Sigma Aldrich公司， Taufkirchen，德国） 。在CBD + AP安藤-1602 + AP组小鼠得到了蛙皮素，相同的程序，在AP组和2个额外的IP注射： 0.5-mg/kgCBDor 10-mg/kgO-1602 （ BIOTREND有限公司，科隆，德国） ，在第一和紧接第五蛙皮素注射前30分钟给出。 O- 1602 + NS， NS，与“生物多样性公约” + NS组为对照组，小鼠，而不是蛙皮素注射等渗氯化钠溶液， AP相关的组，以相同的程序。 样品的收集和制备
在最后一次注射蛙皮素或NS 3个小时后，所有的动物的异氟醚麻醉下断头处死。收集的血液在肝素处理的管;仔细解剖胰腺和肺，漂洗等渗的氯化钠溶液，然后加权和分为几个部分，并在液氮中冷冻，并存储在—80℃直到用法，除了胰腺的一部分被固定在10％的福尔马林中，立即将血样离心10分钟，以3000rpm的转速，和血浆样品放在管中，并存储在—80℃中用于以后的分析。
病理组织学评价
胰腺组织固定在10％福尔马林中作为前面提到的石蜡包埋，切片（ 5Hm ） ，和由的HE染色和伊红染色。光显微镜下进行研究的幻灯片。十五个随机选择的微观领域，从3张幻灯片在每个组中的3只小鼠研究的调查员所不知道的协议和病理评分提到，有报道：（1）间质和腺泡水肿：为零时，不存在; 1 ，局灶性膨胀的小叶间隔2，小叶间隔扩大扩张; 3，小叶内隔片的焦距扩展; 4，小叶内隔垫的发泡膨胀; （2）存在下，空泡化：零，不存在; 1，小于20 ％， 2，20 ％至35％ ; 3,35 ％至50％ ; 4， 50％以上; （ 3）间质浸润的嗜中性粒细胞或淋巴细胞：零，不存在，1 ， 1〜10 /高功率字段（HP） ，2 ，11至20个/ HP ; 3， 20〜30 / HP ; 4，超过30 / HP;（4）腺泡细胞坏死：为零时，不存在; 1， 1〜 5个/ HP 2 ，5〜 10个/ HP ; 3 ，11至15 / HP ;和4 ，超过15个/ HP 。在每一组中，指的分数水肿，空泡形成，浸润，坏死的最终病理评分结果。二辛可宁酸,蛋白检测试剂盒测定什么用的。
淀粉酶和脂肪酶活力检测
淀粉酶和脂肪酶测定血浆中的的适应性检测试剂盒（ 陈健 ，南京，中国）的活动，并根据制造商的说明进行。淀粉酶活性的一个单位定义为在37℃的降解淀粉10mg的在30分钟。脂肪酶活性的一个单位被定义为降解37℃1Kmol每分钟甘油三酯。结果为每100毫升的血浆（单位/毫升） ，和脂肪酶的活性单位的淀粉酶活性每升血浆（ U / L ）为单位。 IL-6和TNF-α 测量
市售酶联免疫吸附说试剂盒（R＆D系统，英国Abingdon ）被用来检测血清IL- 6和TNF-α在血浆或胰腺组织。将组织匀浆与Pro 200手持式实验室匀浆器（临科学，康恩）以2400rpm转在冰冷的生理盐水中。匀浆的等分试样用于蛋白质终止与二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定（热，罗克福德， Ⅲ）和其余的匀浆和血浆的样品，分别测定IL -6和TNF ，按照制造商的说明。由： 超显微读卡器（ BioTek的，威努斯基， Vt）时，检测到的每个样品一式两份，并测定光密度。IL-6和TNF-α水平计算皮克每毫升血浆（ pg / mL的） ，根据BCA蛋白检测的胰腺组织，IL-6水平在胰腺癌组织中的表达每毫克蛋白在皮克（ pg / mg蛋白） 。 MPO活性检测
在研究中，在肺和胰腺髓过氧化物酶的活动。均化组织样品与Pro 200均化器以2400rpm
在冰冷的生理盐水中。此匀浆的等分试样用于蛋白质测定用BCA蛋白分析，和其余的匀浆用于髓过氧化物酶（MPO）活性检查所购买的检测试剂盒（ 陈健 ，南京，中国） ，根据制造商的说明。被定义为一个单位的MPO活性，分级1Kmol每分钟的过氧化氢，在37℃。根据BCA蛋白检测的胰腺组织， MPO活性为每毫克蛋白质和作为NS对照组的百分比的预先给出最后单位计算。
实时定量RT- PCR
胰腺组织用Trizol试剂（TAKARA，日本滋贺县），并从每个样品中的RNA为3kg总RNA提取，反转录成第一链互补的DNA上标TM II RT试剂盒（ Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）制造商的手册。实时定量逆转录聚合酶链反应（PCR）进行检测GPR55 mRNA的表达，用SYBR PRIMIX前TaqTM试剂盒（Takara ，日本滋贺县）在美国联邦贸易委员会3000 PCR仪（枫树岭，上海，中国） 。由Invitrogen 公司设计并合成引物和探针。聚合酶链反应进行扩增，其结构如下： “热明星” ，与在95℃的初始变性30秒， 5秒，然后40个循环，在60 ℃94℃和31秒，与内含子跨越引物GPR55 。这里所用的正向引物序列的GPR55为5 ¶ - GGACTCATTGGTACTCCTAAGCTGT -3 ¶和反向序列5 ¶ - GCAGATCCCAAAGGTCTTCCT - 3¶ 。
蛋白印迹
胰腺组织匀浆，Western印迹法根据之前的说理描述进行了分析裂解液.主要的兔抗GPR55抗体（恩佐，宾夕法尼亚Plymouth Meeting ）在1:500的稀释和内部控制的β-肌动蛋白抗体（Sigma公司， Taufkirchen，德国）中的1:1000的稀释液。施加适当的IRDye二次抗体（罗克兰， Me）中1:5000稀释，在室温下孵育1.5小时。3.0与Odyssey成像系统（ LI-COR ，林肯，纳布）拍摄的图像进行图像分析系统的蛋白条带的光密度，并在每一组中， GPR55蛋白的表达的调节与相应的β-肌动蛋白，分别。 GPR55 ％的NS对照组的相对表达值。
免疫组织化学
G蛋白偶联受体55蛋白表达胰腺组织中也检测到了用免疫组织化学预先描述.胰腺组织的石蜡切片进行脱蜡通过常规程序，并浸入溶液中的0.01-mol/Lcitric酸为1分钟在95℃，用5 ％山羊血清30分钟，然后在4℃在1:20稀释的兔抗GPR55多克隆抗体（开曼化学，安阿伯，密歇根州）过夜孵育。切片，随后由生物素标记的山羊抗兔IgG在37℃15分钟，和辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白（金桥，北京，中国） 30分钟，在37℃。最后，与二氨基联苯胺染色标本，用苏木精在此染色，和用Leica DM 2500显微镜拍摄（Leica ， Wetzlar，德国）。图像进行半定量的Image-Pro加6.0（居间，特伦顿，NJ） 。从每张幻灯片的5个不重叠的意见进行了分析，并从3个不同的小鼠在各组中重复至少3张幻灯片。平均光密度为代表的阳性染色强度和用百分比 NS组最后表示。
统计分析
从多个测定值分别获得在5个或更多的独立的实验中具有至少6只小鼠，除非特别说明。两组数据之间的单向方差分析（SPSS 13.0软件） ，然后用Bonferroni事后检验多个治疗方法. P<0.05被认为是具有统计学意义的对照数据。
讨论
AP的发病率不断增加， 20世纪70年代以来，其治疗仍是经验性。内源性大麻素系统在许多领域已成为重要的目标，在过去的20年里，特别是在一些炎症性疾病。急性胰腺炎是胰腺的炎症性疾病，和炎症反应是很重要的疾病的发病和发展。大麻对AP的影响已引起，但现有的研究主要集中在经典的大麻素受体，并表现出含糊不清，甚至自相矛盾的结果. 证据指出， GPR55的受体的内源性大麻素，和几个同行评审的研究发现大麻素在GPR55.It的药理学据报道， GPR55集中表现在许多种在小鼠体内的器官，包括脑，肾上腺，脾，空肠
和回肠，肺，肾，但并没有提及胰腺。所示，在本研究中，我们的工作发现， GPR55的表达在小鼠胰腺组织.
在这里，我们诱导的小鼠AP的IP注射蛙皮素，它是广泛使用和接受的，显示的模型在组织学和酶学的AP的典型标志。使用这个模型中，新的大麻， O- 1602和“生物多样性公约” ，早期的保护作用进行了探讨。从结果来看，改善证明病理变化和减少观察脂肪酶和淀粉酶的活动，这表明， CBD和O -1602小鼠雨蛙肽诱导的AP上的胰腺组织的保护作用。促炎细胞因子的脉冲串被参与开发发展的AP，和IL-6和TNF-α >已被提议作为更好的炎症标记物的疾病。检测到的血浆IL-6和TNF- >清除消炎的作用， O- 1602和“生物多样性公约” 。据表明， IL-6和TNF-α >血浆中的水平增加了显着的小鼠与AP ，但在研究中， CBD可以扭转程度的增加TNF-α和IL-6的两个，而O- 1602逆转增加TNF - >只。
蛋白质的提取与检测
篇三:二辛可宁酸,蛋白检测试剂盒测定什么用的
蛋白质的提取与检测
第一节 细胞总蛋白的提取及含量测定
【基本原理】
蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）与二辛可宁酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
Lowry法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。
Bradford法：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。
BCA（Bicinchoninic acid）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（Biuret reaction）并与BCA相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
【试剂配制】
1. 1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：0.174g PMSF溶解于100ml异丙醇，分装于
1.5ml离心管中，-20℃保存。
2. 细胞裂解液：50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1mM PMSF，1mM
EDTA，1% Triton X-100，4℃保存。
3. 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.1g，0.15mol/L NaCl 1ml，充分溶解
后-20℃保存。
4. 0.15mol/L NaCl：0.877g NaCl溶解于100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。
5. 考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 100mg，95%乙醇 50ml，磷酸
100ml，加去离子水至1L。先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和去离子水，混匀后滤纸过滤，4℃保存。
6. PBS缓冲液（pH 7.4）：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.63g，KH2PO4
0.24g，溶解于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加去离子水定容至1L，常温保存备用。
【操作步骤】
一、细胞总蛋白的提取
1. 人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231与食道癌细胞系EC109于含10% FBS
的DMEM培养基，37℃、5% CO2条件下常规培养。
2. 去除培养液后以预冷的PBS冲洗2～3遍。
3. 加入适量的预冷的裂解液后置于冰上20～30 min，不时摇动。
4. 用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，转移将细胞碎片和裂解液至预冷的
1.5ml离心管中；。
5. 4℃、12 000 rpm离心15min。
6. 将上清分装至1.5ml的EP管中，-20℃冻存备用。
二、蛋白含量测定（BCA法）（碧云天P0012）
1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 完全溶解蛋白标准品，取10uL稀释至100uL，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
3. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20uL加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20uL。
4. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液（PBS）到20uL。每个样品三个重复。
5. 各孔加入200uLBCA工作液，37℃放置30分钟。也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
6.酶标仪测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
标准品浓度
标准品OD值 ug/uL
0.078 0
0.099 0.025
0.118 0.05
0.154 0.1
0.213 0.2
0.283 0.3
0.329 0.4
0.404 0.5
第二节 SDS-PAGE电泳
【基本原理】
SDS-PAGE电泳技术（SDS polyacrylamede gel electrophoresis）首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。
SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键（氢键和疏水键）。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子或其亚基与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质-SDS复合物基本上是相同的，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量的大小。当蛋白质的分子量在15～200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。因此，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质的分子量。
【试剂配制】
1. 10%SDS：10g SDS加入100ml去离子水中，50℃水浴下溶解，室温保存。
2. 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）：Tris-base 45.43g，加入200ml去离子水溶解后，
用浓盐酸调pH至8.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
3. 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）：Tris-base 30.29g，加入200ml去离子溶解后，用
浓盐酸调pH至6.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
4. 电泳缓冲液：Tris-base 3.03g，Glycine 18.77g，SDS 1g，加入适量去离子水
溶解后定容至1L，室温保存。
5. 5×Loading buffer：50%甘油，250 mM Tris-HCl（pH6.8），10% β-巯基乙醇，
2.5‰溴酚蓝，10% SDS。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
6. 10%过硫酸胺（AP）：0.1g过硫酸胺溶解于1.0ml去离子水，4℃保存，保存时
间为2周。
7. 四甲基乙二胺（TEMED）：分装少量原液于棕色瓶，4℃避光保存。
8. 30% Acr/Bic（37.5:1）：丙烯酰胺（Acr）29.2g，甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g，
加入适量去离子水于37℃下充分溶解并定容至100ml，4℃保存。
注意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和积累，应戴手套进行操作。
9. 凝胶脱色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去离子水定容至1L，室温保存。
10. 考马斯亮蓝G250蛋白染色液：0.1g考马斯亮蓝G250溶解于100ml脱色液中，
混匀后滤纸过滤去除颗粒性物质，置于棕色瓶中室温保存。
11. 凝胶保存液：450ml脱色液中加入50ml甘油，混匀后室温保存。
12. SDS-PAGE浓缩胶（5% Acrylamide）配方：
13. 分离胶配方
BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明书
篇四:二辛可宁酸,蛋白检测试剂盒测定什么用的
产品简介
蛋白质定量是蛋白质研究的基础工作之一。博奥森开发的BCA蛋白质检测试剂(bicinchoninic acid)是理想的蛋白质定量方法;是当前比Lowry法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品。该方法以快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍受专业人士的青睐。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。该产品不受此影响，因此与之配合使用，可免除您实验中的许多烦恼。
基本原理
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
主要特点
1.准确灵敏, 线性范围广: BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml；
2.快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。
3.经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
4.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
5.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。
包装及保存
BCA试剂A70ml室温保存
BCA试剂B1.4ml室温保存
蛋白标准C0.5ml-20℃保存(5mg/1ml BSA)
本试剂盒自订购之日起一年内有效。
注意事项
1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃
2.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。
3.要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔, 每次均应做标准曲线。
4.当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周。二辛可宁酸,蛋白检测试剂盒测定什么用的。
5．需准备37℃水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm之间，562nm最佳。酶标仪需与96孔酶标板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减 少。使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。 使用说明
1.配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2.稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100微升（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。
3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20微升。
4.各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。
5.冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
产品简介
蛋白质定量是蛋白质研究的基础工作之一。博奥森开发的BCA蛋白质检测试剂(bicinchoninic acid)是理想的蛋白质定量方法;是当前比Lowry法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品。该方法以快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍受专业人士的青睐。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。该产品不受此影响，因此与之配合使用，可免除您实验中的许多烦恼。
基本原理
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
主要特点
1.准确灵敏, 线性范围广: BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml；
2.快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。
3.经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
4.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
5.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。
包装及保存
BCA试剂A70ml室温保存
BCA试剂B1.4ml室温保存
蛋白标准C0.5ml-20℃保存(5mg/1ml BSA)
本试剂盒自订购之日起一年内有效。
注意事项
1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃
2.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。
3.要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔, 每次均应做标准曲线。
4.当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周。
5．需准备37℃水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm之间，562nm最佳。酶标仪需与96孔酶标板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减 少。使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。 使用说明
1.配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2.稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100微升（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。
3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20微升。
4.各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。
5.冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
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